Western-blot 實(shí)驗原理、實(shí)驗步驟及試劑選擇指南

Western，也稱(chēng)Western blot、Western blotting、Western印跡，是用抗體檢測蛋白的常用的方法之一。本文分別介紹western 的實(shí)驗原理、實(shí)驗步驟以及試劑選擇指南。  

實(shí)驗原理：

Western技術(shù)是通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，經(jīng)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。

實(shí)驗步驟：

1.收集蛋白樣品

用適當的裂解液處理貼壁細胞、懸浮細胞或組織樣品。某些特定組分的蛋白的蛋白抽提，請欣博盛為您查詢(xún)。  

收集完蛋白樣本后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。 

2. 電泳

2.1 SDS-PAGE凝膠配置

2.2 樣本處理

在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。

2.3 上樣與電泳

冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內即可。為了便于觀(guān)察電泳效果和轉膜效果，以及判斷蛋白分子量大小。

通常電泳時(shí)溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據預染蛋白質(zhì)分子量標準的電泳情況，預計目的蛋白已經(jīng)被適當分離后即可停止電泳。

3. 封閉

轉膜完畢后，立即將蛋白膜放置到預先準備好的Western洗滌液中，漂洗1-2分鐘，以洗掉膜上的轉膜液。吸盡洗滌液，加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉60分鐘。對于一些背景較高的抗體，4℃封閉過(guò)夜。

4. 一抗孵育

吸盡封閉液，加入稀釋好的一抗，室溫搖床上孵育1小時(shí)或者4℃孵育過(guò)夜。Western結果通常需要提供內參作為對照。通常選用Tubulin或Actin抗體，進(jìn)行內參檢測。

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5. 二抗孵育

吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或者4℃搖床上孵育1小時(shí)。SouthernBiotech能夠提供多種不同標記的二抗。 

6. 蛋白檢測

6.1 ECL化學(xué)發(fā)光，顯影，定影

將A和B兩種試劑在離心管中等體積混勻；1 min后，將溶液平鋪在膜蛋白面，暗室反應2min后去盡殘液，包好，放入X-光片夾中。在暗室中顯影定影。

6.2 凝膠圖像分析

將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統分析目的條帶和內參條帶的凈光密度值以及他們的比值。