脂質(zhì)體作為體內和體外輸送載體的工具，已經(jīng)研究的十分廣泛，中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA，借助脂質(zhì)膜將DNA導入細胞膜內。帶正電的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，DNA并沒(méi)有預先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負電的DNA自動(dòng)結合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復合物，從而吸附到帶負電的細胞膜表面，經(jīng)過(guò)內吞被導入細胞。下面讓我們一起來(lái)看看脂質(zhì)體轉染的原理與方法吧！
脂質(zhì)體轉染操作步驟
進(jìn)行實(shí)驗之前，請先規劃好實(shí)驗，一般細胞轉染需要24h-72h，所以要充分了解細胞生長(cháng)速度，計算所需脂質(zhì)體和DNA的儲備量，并確認準備好所需試劑：Opti-MEM無(wú)血清培養基，Lipofectamine轉染試劑，以及DNA。
1、細胞鋪板
?。?）一般會(huì )選擇復蘇細胞傳代3-4次，從解凍過(guò)程中恢復過(guò)來(lái)可以穩定生長(cháng)的細胞進(jìn)行細胞轉染，傳代次數高(>30-40)時(shí)，細胞的生長(cháng)速度和形態(tài)會(huì )改變。
?。?）如果提總蛋白，一般選擇六孔板進(jìn)行轉染，因為轉染的細胞提取蛋白的總量能達到200ug，一般夠做并且需要的DNA和Lipofectamine又相對比較少。
?。?）傳代條件取決于所用的細胞系。對于快速生長(cháng)的細胞，倍增時(shí)間為16小時(shí)(如HEK293)。對于生長(cháng)緩慢的細胞，倍增時(shí)間為36小時(shí)(如原代細胞)。
?。?）轉染當天，將細胞鋪板。如果在轉染前一天或更早時(shí)間鋪板，轉染效率可能下降，如果是簡(jiǎn)單細胞系的轉染，可以直接在前一天晚上鋪板，第二天來(lái)轉染。轉染時(shí)，細胞密度會(huì )影響轉染效率，細胞密度保持在匯合率為70-90%（這個(gè)前提是轉染24h，如果轉染48h則需要匯合率為50-70%），細胞的鋪板和轉染也可同時(shí)進(jìn)行。
2、細胞轉染
吸去培養皿中的培養基，用PBS或者無(wú)血清培養基清洗一次。更換無(wú)血清培養基。準備轉染制備液，用滅菌后的EP管制備。以六孔板為例，A液：用200μl Opti-MEM稀釋4μg質(zhì)粒；B液:用200μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000，分別將A液、B液輕輕混勻，靜置5min，吸取B液加入至A液中，輕輕混勻，室溫靜置20min。加入轉染試劑到每個(gè)孔的培養基中，6h后，更換成完q培養基，繼續培養到24-48小時(shí)（不同的質(zhì)粒和脂質(zhì)體最佳搭配比例不同，轉染前，應該摸一個(gè)最佳配比。質(zhì)粒：脂質(zhì)體=1：1，1：1.5，1：2，1：2.5，1：3，1：3.5的梯度比例來(lái)檢測最佳轉染比例，一般質(zhì)粒有帶熒光，可以通過(guò)觀(guān)察每組熒光強弱來(lái)判斷轉染效率）。以下為不同規格的培養板需要加DNA和lipo2000的量。
更多有關(guān)脂質(zhì)體轉染的原理與方法，請聯(lián)系北京百奧創(chuàng )新科技有限公司！
